APLICAÇÕES DA CITOGENÉTICA
E DA GENÉTICA MOLECULAR EM LEUCEMIAS
Profª Drª Agnes Cristina Fett Conte
Serviço de Genética – Hospital de Base
– FAMERP/FUNFARME
E-mail: genetica@famerp.com.br
As doenças genéticas podem ser classificadas
em gênicas (envolvimento de um gene,
com padrão de herança específico),
cromossômicas (envolvimento de vários
genes localizados no segmento cromossômico alterado),
multifatoriais (envolvimento de vários
genes e participação do ambiente) e somáticas
(alteração do material genético restrita
ao tecido somático; sem risco para a prole).
O material genético pode ser analisado em diferentes
níveis de resolução. Quando a análise
é realizada em cromossomos e com a utilização
de técnicas convencionais, é denominada citogenética,
quando o alvo da análise é a molécula
do DNA ou partes dela, a análise é denominada
molecular, e quando é investigado
o núcleo interfásico ou metáfase, em
lâminas, com a utilização de estratégias
moleculares, a análise é denominada citogenética
molecular.
O câncer (neoplasia maligna), por
exemplo, é uma doença genética que
apresenta tipos correspondentes a todas estas classes, que
podem ser estudados nos diferentes níveis de resolução.
Ocorre uma multiplicação e disseminação
incontroladas no organismo de formas anormais de suas próprias
células. Resulta de alterações nos
processos de diferenciação e proliferação
celulares, que levam, muitas vezes, à morte. Envolve
modificações pleiotrópicas do estado
celular à partir do acúmulo de alterações
genéticas e epigenéticas.
A associação entre alteração
genética e câncer se iniciou em 1960, com descoberta
do cromossomo Philadelphia, um cromossomo resultante da
translocação t(9;22), primeira aberração
cromossômica associada a um tipo específico
da doença, a Leucemia Mielóide Crônica.
A carcinogênese é hoje considerada
como um processo genético de múltiplos passos
onde: alteração inicial ® divisões
celulares sucessivas ® alterações adicionais
® vantagens seletivas ® malignidade (metástase).
Os genes relacionados com a etiologia do câncer são
basicamente classificados em oncogenes
(derivados de proto-oncogenes – crescimento e diferenciação
- cânceres esporádicos) e genes supressores
de tumor (controle negativo do crescimento e diferenciação
– cânceres hereditários).
A identificação de alterações
específicas relacionadas ao câncer pode levar
a:
· Compreensão dos mecanismos biológicos
(etiologia e patogênese)
· Classificação
· Diagnóstico
· Evolução
· Prognóstico
· Decisão terapêutica
· Resposta terapêutica (sucesso)
As leucemias, por sua vez, são
neoplasias malignas das células hematopoiéticas,
que se originam na medula óssea e se espalham no
sangue periférico, podendo atingir diferentes tecidos
e órgãos. De acordo com o tipo de célula
envolvida e com o estado de maturação, são
classificadas, respectivamente, em mielóides ou linfóides
e em agudas ou crônicas.
A análise das alterações genéticas
destas neoplasias pode ser feita por citogenética
convencional. Envolve cultivo celular (cultura
de células da medula óssea) e diferentes técnicas
de bandamento cromossômico. Portanto:
· é fundamental e de custo baixo;
· permite a detecção das alterações
específicas de acordo com a HD e de outras alterações
(primárias e secundárias – evolução
clonal);
· permite a investigação quantitativa
e qualitativa;
· apresenta algumas dificuldades:
· necessita de células em divisão
(nível de resolução)
· não permite o esclarecimento de rearranjos
complexos e de cromossomos marcadores
A análise destas neoplasias também pode ser
realizada com o uso de técnicas moleculares
de diversos tipos. Por exemplo, a análise por RT-PCR
permite a detecção de produtos gênicos
específicos (expressão) decorrentes da fusão
de genes diferentes envolvidos em rearranjos (AML1-ETO resultantes
da t(8;21)(q22;q22) em Leucemia Mielóide Aguda do
sub tipo M2).
As técnicas moleculares freqüentemente envolvem
o uso de sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA
marcados, usados nos procedimentos de hibridização
molecular, para identificar seqüências que sejam
homólogas às suas.
Existem, ainda, as técnicas citogenéticas
moleculares, entre as quais, FISH
(Hibridização In Situ Fluorescente –
a primeira e da qual derivaram todas as demais), CGH
(Hibridização Genômica Comparativa)
e SKY (Cariótipo Espectral). Se
baseiam no princípio de que uma cadeia única
de DNA (sonda marcada com fluorocromo) tem a habilidade
de se anelar (justapor-marcar) a uma cadeia complementar.
O alvo é o DNA nuclear fixado na lâmina (núcleo
interfásico ou células em divisão –
cromossomos).
F I S H
Benefícios:
· 100% sensibilidade e especificidade
· Núcleos interfásicos
· Resultados precisos e rápidos (4 horas)
· Sem risco de contaminação
Dificuldades:
· Custo alto
· Alterações adicionais não
podem ser detectadas
· Exigência de alta qualidade das preparações
Assim, análise genética das leucemias pode
ser realizada por diferentes métodos e técnicas,
complementares entre si. Especificamente a utilização
das técnicas citogenéticas (convencionais
e moleculares) permite:
1. Identificação e quantificação
de alterações específicas em células
metafásicas e interfásicas (submicroscópica
em GTG);
2. Confirmação/exclusão diagnóstica;
3. Detecção de mosaicismo de freqüência
baixa;
4. Avaliação de progressão/remissão
e de crise blástica;
5. Monitoramento após TMO (100% especificidade e
sensibilidade);
6. Identificação de anomalias e polimorfismos;
7. Explicar o fenótipo hematológico [Ph com
inv(3)(q21q26) = LMC com transformação megacarioblástica];
8. Associação com outras técnicas
moleculares/custos/benefícios.
