Resumo das Monografias – 1ª Turma do curso de Biologia Molecular

Células Tronco

Autor: Celso Fernando Góes

Resumo: Um novo ramo da área biomédica baseado na utilização de células tronco, chamado medicina regenerativa, vem despertando a esperança de profissionais e pacientes nos mais diferentes aspectos da saúde humana. Trata-se da utilização de um tipo de células que têm a capacidade de se “transformar” em qualquer outro tipo celular. Estas são chamadas células tronco e, como a denominação indica, são como o tronco de uma árvore, que pode diferenciar-se nos mais diferentes ramos. As células tronco são as precursoras de muitas outras células que formam o corpo do ser vivo. Na espécie humana, um novo indivíduo é gerado pela fecundação do gameta feminino (ovócito) pelo gameta masculino (espermatozóide). Após a fertilização, forma-se a primeira célula (chamada zigoto) que, por meio de divisões sucessivas, dará origem ao embrião. O zigoto, portanto, é capaz de gerar todos os tipos celulares existentes em um organismo adulto. Por volta de 4 dias após a fecundação, o concepto pré-embrionário tem cerca de 50 células que continuarão dividindo, dispondo-se em duas camadas celulares. Antes do final da primeira semana de desenvolvimento, as células da camada interna originarão o embrião. São as células do embrião que são as chamadas células tronco, e são elas que têm potencialidade biológica para diferenciar-se em células específicas de tecidos de qualquer órgão ou estrutura do corpo humano. Mas além das células tronco embrionárias, nosso corpo tem um estoque de células maduras, encontradas no organismo de pessoas adultas. Foi constatado que a pele, intestino, medula óssea, fígado, pâncreas, músculo esquelético, tecido adiposo e tecido nervoso têm um estoque de células tronco com uma capacidade de regeneração após lesões. Observou-se, ainda, que tais células tronco adultas não são apenas multipotentes (capazes de gerar células específicas de seu próprio tecido), mas são também pluripotentes (podem também gerar células específicas de outros tipos de tecidos, como aqueles do embrião). Experimentos têm demonstrado que, quando mantidas em laboratório recebendo tratamentos especiais, tais células conseguem se diferenciar podendo ser, posteriormente, transplantadas num indivíduo com a finalidade de substituir células danificadas ou regenerar tecidos de órgãos doentes. Com este rápido procedimento, a medicina regenerativa prevê tratar dezenas de enfermidades, sem correr o risco da incompatibilidade imunológica. Sob o ponto de vista curativo, não há como negar a evidente utilidade terapêutica e os benefícios médicos deste procedimento, basta ainda que muitas investigações sejam realizadas.


Testes de Quantificação Viral do HIV-1

Autor: Cibele Cazonato Moreira

Resumo: A partir da descoberta do vírus da AIDS e da possibilidade de infecção via transfusão sangüínea, o desenvolvimento de um kit-diagnóstico se tornou prioritário. O avanço das pesquisas tem levado ao desenvolvimento de tecnologias adequadas para avaliar laboratorialmente o curso da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana – HIV, principalmente nos portadores que ainda não apresentam sintomas da síndrome da imunodeficiência humana adquirida – AIDS. O HIV tem como material genético o RNA, e é classificado como retrovírus em função de possuir a enzima transcriptase reversa. Esta enzima, no estágio inicial da replicação viral, promove a síntese da dupla fita de DNA viral a partir de um molde de RNA. O nível de RNA do HIV no plasma é um marcador clínico importante. O número de partículas virais é mais elevado durante a infecção primária e mais baixa na fase assintomática. Existe uma relação direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com que a infecção progride. Níveis elevados da replicação do vírus e o aumento da carga viral estão associados à deterioração acelerada do sistema imune. Os testes de carga viral medem o número de partículas do HIV presentes no sangue periférico. Nesse tipo de teste, o HIV é detectado pelo seu material genético e as metodologias disponíveis baseiam-se na amplificação direta ou indireta dos ácidos nucléicos. Dessa forma na tecnologia NASBA e no Amplificador HIV Monitor Test a amplificação é direta, ou seja, ocorre um aumento da quantidade de ácido nucléico e detecta-se o produto final por hibridização; no Quantiplex HIV-RNA a amplificação é indireta, ocorre primeiro uma hibridização e depois uma amplificação do sinal do produto hibridizado. Essas três metodologias de quantificação do RNA viral apresentam eficácia semelhante e são muito reprodutíveis. Entretanto, elas estão baseadas em princípios diferentes e, por isso, sugere-se que os resultados sejam comparados dentro do mesmo método.


Atualização no diagnóstico em leucemias através da biologia molecular

Autor: Deborah Vittori

Resumo: As leucemias são um grupo muito heterogêneo de doenças que variam na sua etiologia, curso clínico e prognóstico. Um diagnóstico e uma classificação precisa em leucemia obtidos através de um guia completo dos princípios do diagnóstico e da classificação, podem determinar em última análise, a escolha da terapia e o possível prognóstico da doença para o paciente. O diagnóstico e a classificação das leucemias podem assim ser discutido de forma útil à hematologistas e aos cientistas de laboratório em hematologia e em disciplinas relacionadas. Além disso, os estudos de citogenética e genética molecular podem aumentar a compreensão da relação destas disciplinas com o diagnóstico, classificação das leucemias e dos distúrbios relacionados. Os genes envolvidos nas aberrações genéticas em leucemias agudas possuem um papel importante no desenvolvimento e função de células linfóides e mielóides. Eles geralmente codificam fatores de transcrição, mas também são responsáveis pelos reguladores do ciclo celular, sinal de transdução de moléculas, receptores, ou moléculas de TCR e Ig. Vários estudos clínicos tem mostrado que aberrações cromossomais em leucemia linfóide aguda (LLA) e leucemia mielóide aguda (LMA) podem ser usadas para classificação de grupos de risco, ao passo que a translocação t(12;21) em LLA, assim como as translocações T(8;21), t(15;17) e também a inversão inv(16) em LMA estão associadas com um bom prognóstico. Além desta classificação citogenética molecular no diagnóstico da leucemia aguda, aberrações cromossômicas com regiões de fusão de genes específicos de leucemia, podem também ser usados como moldes para reações de PCR na detecção de DRM, durante acompanhamento médico ao paciente. Está claro que estes estudos prováveis sobre doença residual mínima são viáveis e que uma classificação de grupos de risco em doença residual mínima clinicamente relevantes podem ser obtidos e então utilizados para se estabelecer novos protocolos de tratamento. Além da reação polimerase em cadeia (PCR), podemos contar com outros métodos para o estudo genético de células neoplásicas, tais como, análise de cariótipo, análise de hibridização in situ fluorescente, análise Southern Blot e mais recentemente o método das estruturas de microarranjos de DNA que permitem uma análise rápida e compreensiva da transcrição celular através da hibridização do RNA mensageiro marcado com sondas de DNA, que são imobilizadas em um suporte sólido. É provável que os microarranjos de DNA venham substituir a maioria dos outros métodos rotineiros de varredura para mutações. A tecnologia de chip gênico promete revolucionar a varredura para mutações, bem como outras áreas da genética molecular humana. Todavia, a revolução ainda não aconteceu. Os últimos avanços são abordados por Hacia (1999).


Triagem molecular para HCV em doadores de sangue

Autor: Denise C. Martins Basso

Resumo: A Hepatite C é hoje a principal causa das hepatites por transmissão parenteral. Constitui um dos mais importantes problemas de saúde pública da atualidade, devido a sua alta prevalência de 0,5 a 15% entre doadores de sangue e elevada proporção para evolução crônica da doença, que chega atingir 85% dos casos. A infecção é geralmente assintomática, podendo produzir cirrose em 20% dos casos e destes desenvolver câncer primário do fígado em um grande percentual deles. Sabe-se, hoje, que a grande maioria das hepatites virais, antes rotuladas não-A-não-B, eram na verdade, causadas pelo HCV. A disponibilidade de teste diagnósticos data de 1989, quando foi decodificado o genoma do HCV por Choo et al. A produção de antígenos e peptídeos sintéticos possibilitou o desenvolvimento de testes que permitem a detecção de anticorpos contra o HCV (Anti-HCV), como os testes ELISA (enzyme – linked immunosorbent assay), RIBA (recombinant immunoblot assay) e Western-Blot. A terceira geração desses testes, que já está disponível, é proporcionalmente mais sensível e específica do que a primeira e segunda gerações. O desenvolvimento de técnicas para detecção qualitativa e quantitativa do ácido ribonucléico (RNA) do HCV, por meio da reação em cadeia polimerase (polymerase chain reaction, PCR), aumentou a sensibilidade diagnóstica. Também tornou-se possível determinar o genótipo do HCV em laboratórios clínicos, o que pode ser útil em situações específicas. A disponibilidade de diferentes testes viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o potencial para disseminação da infecção, e torna relevante a discussão das indicações de cada teste, a partir de sua sensibilidade e especificidade. Atualmente, o método mais utilizado para detecção de anticorpo contra o HCV é o teste imunoenzimático ELISA da 3ª geração, que contém frações antigênicas das regiões não estruturais e da região estrutural do vírus. Os testes RIBA, Western-Blot e PCR são utilizados como ensaios suplementares. Hoje, por meio das técnicas PCR e NAT, é possível acompanhar o estado de infecção pelo HCV, determinar seus genótipos, conduzir melhor o tratamento e diminuir as possíveis contaminações por transfusões de sangue, caracterizando os indivíduos que realmente possuem o vírus e diminuir a fase da “janela imunológica”, que é o período prévio à soroconversão. Os estudos para o desenvolvimento de uma vacina anti-HCV ainda estão em andamento, portanto recomenda-se a triagem cuidadosa na doação de sangue e o uso de medidas de prevenção em situações profissionais e práticas sexuais. Atualmente são esses os únicos meios seguros de reduzir a infecção pelo HCV.


Aplicações básicas da biologia molecular no diagnóstico da anemia falciforme

Autor: Eunice de Paiva R. Fernandes

Resumo: A Anemia Falciforme (Hb SS) é caracterizada como uma das doenças genéticas mais freqüentes na população brasileira. A mutação que ocorreu no gene da Hb S é causada por uma alteração na cadeia beta, decorrente da substituição de uma base nitrogenada, a adenina (A), por outra, a timina (T) no sexto códon do gene beta, que de GAG passa para GTG, provocando a substituição do ácido glutâmico pela valina na cadeia polipeptídica. Essa simples substituição de um nucleotídeo no DNA e de um único aminoácido na cadeia polipeptídica leva a hemoglobina a assumir uma configuração espacial diferente, que causa a deformação das hemácias fazendo com que estas células assumam a forma de meia-lua ou de foice. Dentro de um mesmo genótipo Hb SS pode-se observar variações individuais e regionais influenciadas por fatores genéticos e ambientais, sendo de fundamental importância um diagnóstico laboratorial preciso dessa alteração genética. Vários fatores modificantes vêm sendo estudados, sendo os mais importantes atualmente: os níveis de Hemoglobina Fetal (Hb F), a coexistência de outras hemoglobinopatias hereditárias e os diferentes haplótipos para a Hb S. A Biologia Molecular tem provocado notável evolução nos métodos de diagnóstico da Anemia Falciforme. Conhecimentos sobre a regulação da expressão gênica e a possibilidade da transfecção de genes para células progenitoras hematopoiéticas abrem campos de investigações importantes para o tratamento dessa doença. A reação de polimerização em cadeias (PCR-Polimerase Chain Reaction) revolucionou a biologia molecular, permitindo o rápido avanço na codificação genômica, visto que requer um mínimo de material gênico para sua realização. Permitiu, também, o desenvolvimento de novas técnicas de análise clínico-laboratorial e um rápido avanço em diversas áreas da Biologia e da Medicina, com um acúmulo de novos conhecimentos extremamente rápidos – em menos de uma década. Diante dessas considerações, essa pesquisa teve como objetivos: a) revisar a literatura sobre os principais conceitos relacionados à epidemiologia, fisiopatologia, terapia e variabilidade molecular da Anemia Falciforme e b) descrever a evolução dos métodos moleculares de diagnóstico da Anemia Falciforme. Cada vez mais os profissionais de saúde necessitarão acompanhar as novas informações científicas. A correta identificação e caracterização da Anemia Falciforme, as reativações dos genes gama, por agentes farmacológicos, para indução de hemoglobina fetal, bem como, a prevenção, por meio do aconselhamento genético, são as maneiras mais eficientes de se lidar com essa doença. Apesar dos esforços de vários cientistas, no sentido de amenizar o sofrimento de pacientes e familiares acometidos pela Anemia Falciforme, o tratamento dessa doença genética, mesmo quando disponível ainda é inadequado. Infelizmente os métodos de tratamento não evoluíram na mesma proporção. Dessa forma, a perspectiva de se intervir diretamente no gene alterado, corrigindo-se o defeito primário, ainda consiste na maior esperança de tratamento da Anemia Falciforme.


Terapia Gênica

Autor: Franciele Alves Constantino

Resumo: A consideração dos problemas éticos potenciais da terapia gênica deve levar em conta as diferenças intrínsecas entre a terapia das células somáticas e da linhagem germinativa. Na proposta atual da terapia somática, um gene inserido no indivíduo com a finalidade de corrigir uma doença genética e, caso o tratamento seja um sucesso, o gene funcionará somente durante o período de vida daquele indivíduo. Por ser um procedimento que do ponto de vista ético, não difere de um transplante de órgãos, tem sido, geralmente, aceito por grupos religiosos e aprovado por vários governos. Na terapia gênica das células germinativas, que na prática significa inserir um gene em ovos fertilizados ou em embriões no início do desenvolvimento, o gene exógeno estaria presente em todas as células do futuro indivíduo, podendo também ser transmitido para as gerações futuras. Certamente tal proposta envolve problemas éticos muito mais sérios e tem sido considerada inaceitável no presente momento. Primeiro, a inserção de genes em ovos fertilizados envolve riscos aceitáveis para a criação de animais transgênicos, mas inconcebíveis para a espécie humana. Segundo, no que se refere à eliminação de defeitos genéticos graves o diagnóstico pré-natal e o aborto terapêutico, serão, por longo tempo ainda, soluções muito seguras com menores consequências éticas e morais. Outro ponto a ser considerado é que atualmente não se tem idéia sobre qual seria a estabilidade de um gene exógeno nas gerações futuras e nem sobre seus possíveis defeitos deletérios a longo prazo. Pelas razões apresentadas anteriormente, a curto ou a médio prazo não há razões para se considerar a terapia das células germinativas como um procedimento aceitável na espécie humana, mas todas as restrições para que a terapia gênica aconteça é conseqüência da juventude da tal técnica. Sendo preciso ainda muitas pesquisas, estudo e tentativas para que em um futuro próximo as doenças sem cura na atualidade recebam um tratamento facilitado.


Diabetes

Autor: Gabriela Hildebrand Issa

Resumo: O diabetes, doença que compromete o organismo de utilizar a glicose, pode no início não manifestar sintomas. Quando estes sintomas se manifestam, é sinal de que algo em nosso organismo está exigindo mais do que podemos suportar. Esta doença em casos mais leves, pode não apresentar sintomas. Somente através de exames de rotina como: exame de urina e de sangue será diagnosticado o açúcar na urina e o aumento da taxa de glicose no sangue. Muitas pessoas, por não realizarem os exames, não aceitam quando a doença aparece, pois esta é uma doença silenciosa e incurável. O diabetes ocorre com freqüência em pessoas obesas, que possuem uma vida sedentária. A melhor maneira de se tratar é fazendo atividades físicas e mudando o modo da alimentação e levar uma vida sem muita agitação e estresse.


Distúrbios Mitocondriais

Autor: Janeth Silva Pinheiro

Resumo: A mitocôndria é uma organela intracelular, responsável pela respiração celular. A energia armazenada é utilizada pelas células para realizar suas funções como: movimentação, secreção e multiplicação. Possui duas membranas (interna e externa), o espaço na membrana interna é chamado de matriz mitocondrial, onde contém várias cópias idênticas do DNA genômico mitocondrial, ribossomos mitocondriais especiais, RNAs e enzimas necessárias para a expressão dos genes mitocondriais. Tem seu próprio DNA que é uma molécula circular, tem 16,5kb de tamanho que codifica 22 moléculas de RNA transportador, 2 RNA ribossômico e 13 subunidades protéicas que fazem parte dos complexos envolvidos na cadeia respiratória, não tem íntrons, é transmitida exclusivamente da mãe. As mutações do DNA são transmitidas pela linhagem materna. A expressão clínica das mutações mitocondriais vai depender da quantidade de DNA mitocondrial mutante existente na célula. Os tecidos que requerem grande quantidade de energia são os mais afetados nos casos de mutações do DNAm, como: células nervosas, musculares, endócrina, ópticas e auditivas. As mutações no DNAm afetam os complexos protéicos da cadeia respiratória, tendo um déficit de energia nos tecidos, onde tem uma grande quantidade de mitocôndrias, os principais distúrbios mitocondriais são: Síndrome de Kearns-Sayre (Kss), Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON), Encefalopatia Mitocondrial (MELAS), Epilepsia mioclônica com fibras vermelhas anfractuadas (MERRF), Surdez não crônica, diabetes.


Diagnóstico molecular da Anemia Falciforme

Autor: Juvanete Amoras Távora Miranda

Resumo: Embora a anemia falciforme tenha sido a primeira doença genética a ser estudada e esclarecida em 1978, pouco se avançou no uso da análise de DNA como diagnóstico desta patologia em razão do alto custo. Apesar da anemia falciforme ser considerada um caso de saúde pública brasileira, somente recentemente tornou-se obrigatório na triagem neonatal (teste do pezinho) a realização de exames para a detecção desta patologia. Em alguns casos a anemia falciforme pode estar associada com outras variantes de hemoglobina, nestas situações a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) ou Southern blotting deve ser indicada como diagnóstico confirmatório. Este trabalho demonstra a evolução do diagnóstico molecular da anemia falciforme através de técnica de análise de DNA, mas em razão do alto custo, sua aplicação é pouco utilizada.


Uso de sequenciamento (genotipagem) do vírus HIV-1 para avaliar resistência aos anti-retrovírus

Autor: Karen Cristina Martins de Almeida

Resumo: O exame da Genotipagem do vírus da Imunodeficiência humana (HIV-1), também conhecido pelo nome de teste da resistência às drogas, tem como objetivo detectar a presença de mutações no genoma viral. Diversos estudos, conduzidos com pacientes em tratamento experimental tem demonstrado fortes associações entre a presença de resistência à droga e falha no tratamento anti-retroviral, em suprimir a replicação do vírus. A interpretação dos resultados de Genotipagem requer análise das mutações levando em consideração as drogas utilizadas, bem como o potencial para resistência cruzada com outras drogas. Para Genotipagem é necessário uma carga viral mínima de 1.000 cópias de vírus circulante, para que seja possível a amplificação e o sequenciamento dos genes virais. Com o uso da enzima transcriptase reversa, um DNA complementar é sintetizado e, posteriormente amplificado pela técnica de PCR. Para cada paciente seqüencia-se tanto o gene da protease como o da transcriptase reversa em um seqüenciador automático. Empregando-se softwares específicos, as seqüências obtidas são compiladas em fita única e comparadas com a descrita como protótipo do HIV-1, para identificação das mutações existentes em cada um dos genes estudados. Tanto a lista de mutações conhecidas como suas interpretações são constantemente atualizadas pelos bancos de dados internacionais. O resultado negativo não afasta a possibilidade da presença de uma população viral resistente. Além disto, o aparecimento de resistência viral, especialmente em pacientes que já fizeram uso de mais de um esquema anti-retroviral, limita severamente uma opção terapêutica futura. Portanto, é de crucial importância que a decisão da escolha de um novo tratamento seja baseada no maior número de informações possíveis. A Genotipagem do HIV-1 é indicada para pacientes que: a) ainda não deram início ao tratamento com drogas anti-retrovirais, para definição do perfil genotípico da população viral infectante; b) apresentam aumento da carga viral ou queda dos linfócitos CD4+ mesmo em tratamento; c) receberam muitas drogas anti-retrovirais; d) recentemente diagnosticados nas áreas de alta prevalência de vírus resistentes.


A biologia molecular no monitoramento de pacientes HIV positivos

Autor: Roberta Barbosa Lopes

Resumo: A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma manifestação clínica avançada da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2), que leva a uma imunodepressão progressiva, especialmente da imunidade celular, resultando em infecções oportunistas, neoplasias e/ou manifestações (demência, caquexia, etc.) que são condições definidoras de AIDS. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em todo o mundo, mais de 42 milhões de pessoas estejam contaminadas pelo HIV, além do número de pessoas infectadas estar aumentando de forma expressiva, principalmente nos países mais pobres ou em desenvolvimento. O Brasil é um dos países com maior número de casos notificados de AIDS no mundo, contando mais de 230mil casos registrados até 2002. Métodos de biologia molecular têm sido amplamente utilizados para a detecção e quantificação do cDNA HIV-1 e RNA HIV-1. Técnicas mais recentes, como hibridização, amplificação e o sequenciamento de nucleotídeos, ou ainda a transferência de moléculas de ácidos nucléicos (recombinantes ou não) para células eucarióticas, têm propiciado ferramentas para um melhor conhecimento de diversos processos biológicos. A Carga Viral é o principal parâmetro para avaliar a progressão da AIDS e monitorar a resposta à terapia antiretroviral, seguido pela contagem de linfócitos CD4+. Altos níveis de HIV RNA plasmático refletem em um pior prognóstico e uma rápida progressão para a AIDS após soroconversão. Diversas metodologias são utilizadas para a quantificação do HIV-1 RNA no plasma, como a RT-PCR (Transcrição Reversa), Amplificação do Ácido Nucléico Baseado na Seqüência (NASBA), ambos baseados nas técnicas de amplificação de ácido nucléico, e o DNA Ramificado ou Branched-DNA (bDNA), que é baseado na amplificação do sinal.


Variação molecular do sistema Rh em pacientes portadores de anemia falciforme

Autor: Silvana de Fátima Furquim

Resumo: O sistema Rh é o maior, mais complexo e mais imunogênico sistema de grupos sanguíneos. Representa um dos sistemas de maior interesse clínico, por seu envolvimento na Doença Hemolítica Peri-Natal; nas Reações Transfusionais Hemolíticas e nas Anemias Hemolíticas Auto-Imunes. Os antígenos do sistema Rh são codificados por dois genes altamente homólogos, RHD e RHCE. As bases moleculares da maioria dos fenótipos Rh foram determinadas nos últimos 10 anos e rearranjos gênicos, deleções e mutações de ponto podem ser responsáveis por algumas variantes dos antígenos RhD e RhCE. A elucidação da base molecular das variantes Rh possibilitou o desenvolvimento de técnicas para a determinação de variantes que parecem ser predominantes em algumas populações. Desta forma, é possível estabelecer a correlação adequada entre os genótipos e os fenótipos e o esclarecimento da perda de expressão de alguns antígenos Rh comuns. A determinação da frequência das variantes Rh em populações distintas pode auxiliar na determinação de fenótipos raros que não são caracterizados sorologicamente. Estudos envolvendo variantes Rh em pacientes falciformes politransfundidos, poderão em futuro próximo auxiliar no melhor entendimento da correlação entre o fenótipo e o genótipo e aumentar a segurança transfusional destes pacientes que muitas vezes desenvolvem anticorpos após transfusional destes pacientes que muitas vezes desenvolvem anticorpos após transfusão de sangue. Tendo em vista a relevância que a caracterização molecular das variantes do sistema Rh pode vir a ter na segurança transfusional de pacientes falciformes, foram nossos objetivos: padronizar técnicas moleculares para realização da genotipagem RHD e RHCE, determinar a frequência do pseudogene RHD e do gene híbrido RHD-CE-DS em pacientes com os fenótipos Ror e rr; verificar a frequência dos antígenos D parciais categorias DIIIa, e DVa e DAR em pacientes RhD-positivo e determinar a ocorrência das variantes do antígeno Rhe em pacientes com o alelo Rhce. A frequência do pseudogene RHD (RHDy ) e do gene híbrido RHD-CE-DS em pacientes falciformes, foi estudada em amostras de DNA de 91 pacientes fenotipados como R0 r e rr através de duas técnicas de PCR multiplex. Nossos resultados demonstraram que dezoito (19,8%) pacientes apresentaram o pseudogene RHD (REIDy ) e dois (2%), o gene híbrido RHD-CE-DS. Estes resultados em conjunto com publicações anteriores que mostram que o pseudogene RHD apresenta alta frequência em populações de origem africana sugerem que a determinação do genótipo RHD deve incluir ampla análise do gene RHD. A frequência dos antígenos D parciais categorias DIIIa, DVa e DAR em pacientes falciformes RhD-positivo foram estudadas em amostras de DNA de 130 pacientes pelas técnicas de PCR-RFLP e de sequenciamento. 25 (19,2%) dos pacientes estudados apresentaram as variantes DIIIa, DVa e DAR. Em quatro (3,1%)destes pacientes foi identificada a variante DVa e em 21 (16,1%) as variantes DIIIa e DAR. A alta frequência destas variantes em pacientes falciformes, principalmente de DIIIa e DAR sugere um aumento no risco de aloimunização ao antígeno RhD, uma vez que estes indivíduos são classificados na rotina como RhD-positivos. A ocorrência das variantes do antígeno Rhe em pacientes falciformes com o alelo RHce associadas às mutações 48C (Cys16) e 733G (VS) foi investigada em 58 amostras de DNA de pacientes portadores de anemia falciforme previamente fenotipados para os antígenos RhD, C/c, E/e e VS pelas técnicas de PCR alelo específico e PCR-RFLP. Dos 58 pacientes estudados, 56 apresentaram a mutação 48C (Cys16) e 50 a mutação 733G (antígeno VS). A ocorrência simultânea destas mutações foi observada em 50 pacientes. Estas mutações encontravam-se em heterozigose, sugerindo que estes pacientes apresentavam a mutação 48C em um alelo e a mutação 733G em outro alelo. A ocorrência simultânea destas mutações levou a uma fraca expressão do antígeno Rhe nas hemácias destes pacientes demonstrada pelo resultado negativo da fenotipagem Rhe com a utilização de três anti-soros monoclonais anti-e. Diante destes resultados recomenda-se que a rotina de fenotipagem Rh de pacientes falciformes seja realizada com a utilização de pelo menos dois anti-soros monoclonais ou com um anti-soro policlonal e outro monoclonal, melhorando desta forma o atendimento à necessidade de transfusão pelo aumento da disponibilidade de sangue. Em conclusão, a caracterização molecular das variantes Rh deve ser recomendada em pacientes falciformes dependentes de transfusão, pois permite a seleção correta do sangue a ser transfundido. Auxilia ainda, na prevenção da aloimunização, podendo diminuir os efeitos de potenciais reações hemolíticas.


Teste de amplificação e detecção de ácido nucléico para o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) em doadores de sangue

Autor: Vânia Maria de Oliveira Nascimento

Resumo: No Brasil para garantir a confiabilidade da transfusão são utilizados ensaios sorológicos para a triagem de doadores de sangue de alta sensibilidade e alta especificidade. Para triagem do HIV são utilizados dois testes. Um dos testes deve ser imunoenzimático. O segundo teste poderá ser outra técnica com princípio metodológico ou antigênico distinto do primeiro teste. Há ainda riscos transfusionais como na janela imunológica (22 dias), os variantes virais (são conhecidos nove subtipos do HIV-1 – de A a I – e o grupo O), nas soroconversões atípicas (imunosilenciosos) e nos erros laboratoriais. A fase de janela imunológica ou o período prévio a soroconversão é o principal risco transfusional. A janela imunológica é responsável por aproximadamente 90% do risco de transmissão do HIV por transfusão de sangue. A disponibilidade no mercado mundial de novas tecnologias para os testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT) para o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e a introdução do mesmo na triagem laboratorial dos doadores de sangue diminui o período de janela imunológica para 11 dias. Nos últimos anos, diversos países da Europa, além dos estados Unidos, Austrália e Japão, introduziram a triagem pelo NAT nos bancos de sangue. A finalidade deste ensaio é possibilitar a realização da triagem de bolsas de sangue a partir de amostras de doadores e determinar a presença do HIV-1 em situações onde tal agente não é detectado pelos testes de triagem sorológica, diminuindo o risco residual de transmissão deste vírus pela transfusão sangüínea. Dois sistemas são utilizados para a triagem de doadores de sangue: o Roche Molecular System – Cobas AmpliScreen PCR e o Gen-Probe Incorporated – TMA do HIV-1/HCV Amplified Assay-CHIRON. As técnicas utilizadas para amplificação de ácidos nucléicos para testar amostras individuais são de um preço alto e, portanto torna-se necessário à realização de amplificações em pool compostos de pequenas alíquotas de amostras individuais. Para a implantação do Teste de Amplificação e de Detecção de Ácido Nucléico para o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) em doadores de sangue, nos serviços de Hemoterapia do Brasil há a necessidade de áreas específicas para a realização do teste, um sistema informatizado com capacidade de interfaciamento: de identificação de amostras, entre os equipamentos que realizam os testes e a transcrição de resultados dos exames. A introdução do Teste de Ácido Nucléico (NAT) prevista para 2004 nos Serviços de Hemoterapia reduzirá para 11 dias a janela imunológica do HIV, haverá uma redução de 50% nos riscos de transmissão por transfusão de sangue. Todas as dificuldades e investimentos serão compensados pela garantia de um produto com qualidade e uma segurança ao paciente que necessita de receber hemocomponentes e hemoderivados sangüíneos.