{"id":1715,"date":"2013-08-21T19:40:17","date_gmt":"2013-08-21T19:40:17","guid":{"rendered":"http:\/\/www.ciencianews.com.br\/homologacao\/?page_id=1715"},"modified":"2013-08-21T19:40:17","modified_gmt":"2013-08-21T19:40:17","slug":"biologia-molecular-tecnicas-moleculares","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/www.ciencianews.com.br\/index.php\/ciencia\/biologia-molecular\/biologia-molecular-tecnicas-moleculares\/","title":{"rendered":"Biologia Molecular – T\u00e9cnicas Moleculares"},"content":{"rendered":"

A AN\u00c1LISE DE DNA POR ELETROFORESE<\/strong><\/h4>\n

\nCo \u2013 autores: Elisete Marcia Corr\u00eaa<\/b>
\n\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0\u00a0 Patr\u00edcia Abr\u00e3o Possik<\/b><\/p>\n

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Eletroforese de DNA em gel<\/strong><\/p>\n

A an\u00e1lise de DNA por eletroforese \u00e9 uma das t\u00e9cnicas fundamentais nos laborat\u00f3rios de pesquisa e de diagn\u00f3stico. O princ\u00edpio \u00e9 baseado no fato da mol\u00e9cula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo el\u00e9trico, migra em dire\u00e7\u00e3o ao p\u00f3lo positivo (an\u00f4do). A velocidade da migra\u00e7\u00e3o depende do tamanho da mol\u00e9cula. Por isso em um dado momento da eletroforese mol\u00e9culas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz.
\nO tipo de matriz que \u00e9 usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido \u00e0 diferen\u00e7a no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separa\u00e7\u00e3o de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separa\u00e7\u00e3o de fragmentos pequenos, de at\u00e9 1kb. Alternativamente para a resolu\u00e7\u00e3o de fragmentos superiores a 1 kb pode-se utilizar a agarose com baixo ponto de fus\u00e3o (Low Melting<\/i>) que \u00e9 um tipo de agarose derivada de s\u00edntese org\u00e2nica.
\nApesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em solu\u00e7\u00e3o, isto \u00e9, quando n\u00e3o polimerizada, ser neurot\u00f3xica. Assim, a prepara\u00e7\u00e3o do gel exige certa cautela. Al\u00e9m disso, a prepara\u00e7\u00e3o \u00e9 mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais \u00e0 poliacrilamida para ajudar na polimeriza\u00e7\u00e3o e mais tempo para que a polimeriza\u00e7\u00e3o ocorra propriamente.
\nJ\u00e1 o gel de agarose \u00e9 feito apenas atrav\u00e9s da mistura de um tamp\u00e3o e agarose, n\u00e3o apresentando toxicidade. A polimeriza\u00e7\u00e3o \u00e9 mais r\u00e1pida e o gel pode ser reciclado ap\u00f3s o uso, isto \u00e9, pode ser reutilizado na elabora\u00e7\u00e3o de outros g\u00e9is. Al\u00e9m disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como m\u00e9todo anal\u00edtico ou preparativo, isto \u00e9, quando o fragmento de DNA \u00e9 recuperado e purificado a partir do gel.
\nEntretanto, dependendo do m\u00e9todo utilizado para a visualiza\u00e7\u00e3o do DNA, o gel de agarose pode ser desvantajoso. Frequentemente se utiliza a colora\u00e7\u00e3o com brometo de et\u00eddio (EtBr), uma subst\u00e2ncia mutag\u00eanica. Em adi\u00e7\u00e3o, para a visualiza\u00e7\u00e3o do DNA corado com EtBr, \u00e9 necess\u00e1ria a utiliza\u00e7\u00e3o de transiluminador de luz ultravioleta. Para a utiliza\u00e7\u00e3o de tal aparelho e para a o uso do brometo de et\u00eddio, \u00e9 necess\u00e1rio o cuidado com a biosseguran\u00e7a n\u00e3o somente do manipulador, mas de todos os que compartilham o uso do laborat\u00f3rio.
\nSe houver a necessidade de separar fragmentos maiores do que 50 kb \u00e9 necess\u00e1rio utilizar a eletroforese em campo pulsado (pulse-field gel electrophoresis\u00a0<\/i>\u2013 PFGE), que consiste, simplificadamente, de um gel submetido a uma corrente el\u00e9trica que se alterna em dire\u00e7\u00f5es perpendiculares.
\nA seguir ser\u00e3o discutidas as quatro etapas necess\u00e1rias para a realiza\u00e7\u00e3o da eletroforese em gel de agarose, a saber: prepara\u00e7\u00e3o do gel, aplica\u00e7\u00e3o das amostras, corrida eletrofor\u00e9tica e a an\u00e1lise e o registro dos resultados.<\/p>\n

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Prepara\u00e7\u00e3o do gel:<\/strong><\/p>\n

A agarose, um polissacar\u00eddeo extra\u00eddo de uma alga marinha vermelha e formado por res\u00edduos de D e L galactose unidos por liga\u00e7\u00f5es glicos\u00eddicas a (1\u00ae3) e b(1\u00ae4), \u00e9 um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor. Por isso, para se preparar um gel de agarose procede-se de modo similar a prepara\u00e7\u00e3o de uma gelatina. Dissolve-se uma quantidade em gramas do p\u00f3 de agarose, ajustando-se a concentra\u00e7\u00e3o apropriada para separar os fragmentos de DNA presentes na amostra, em um dado volume de tamp\u00e3o de eltroforese. Os dois tipos de tamp\u00e3o mais utilizados s\u00e3o TAE (Tris-acetato-EDTA) e TBE (Tris-borato-EDTA).<\/p>\n

Aquece-se a mistura em forno microondas ou utilizando um bico de\u00a0bunsen<\/i>, at\u00e9 que a solu\u00e7\u00e3o fique homog\u00eanea e transparente. Aguarda-se a diminui\u00e7\u00e3o da temperatura at\u00e9 aproximadamente 50\u00baC e verte-se em uma forma (um tipo de molde espec\u00edfico para o preparo do gel).<\/p>\n

Sobre a solu\u00e7\u00e3o ainda morna coloca-se um pente (uma tira de teflon denteada que ficar\u00e1 a 1 mm acima do fundo da forma) que servir\u00e1 como molde para produzir diversas cavidades (po\u00e7os) no gel. Essas min\u00fasculas cavidades n\u00e3o chegam a atravessar o gel e servir\u00e3o como reservat\u00f3rios onde as amostras de DNA ser\u00e3o aplicadas. Ao esfriar e polimerizar, a agarose fica com o aspecto turvo e com resist\u00eancia diretamente proporcional \u00e0 concentra\u00e7\u00e3o de agarose utilizada.
\nA seguir, a forma contendo o gel \u00e9 colocada no interior da cuba de eletroforese horizontal. Na cuba o gel encontra-se entre fios de platina que atuam como c\u00e1todo e \u00e2nodo provocando a passagem de corrente el\u00e9trica gerada por uma fonte de eletricidade. Adiciona-se o mesmo tamp\u00e3o usado para fundir a agarose em quantidade suficiente para que o gel fique totalmente imerso tomando-se o cuidado para que o n\u00edvel de tamp\u00e3o fique pelo menos 1 mm acima do gel. A seguir retira-se cuidadosamente o pente.<\/p>\n

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\u00a0Aplica\u00e7\u00e3o das amostras:<\/strong><\/p>\n

Antes da aplica\u00e7\u00e3o, as amostras de DNA dever\u00e3o ser misturadas a um tamp\u00e3o de amostra. O tamp\u00e3o de amostra cont\u00e9m corantes e reagentes de alta densidade (sacarose, glicerol ou ficol). Estes \u00faltimos asseguram que a amostra de DNA entre no po\u00e7o pela for\u00e7a da gravidade. J\u00e1 os corantes, azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a aplica\u00e7\u00e3o da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, j\u00e1 que apresentam velocidade conhecida durante a migra\u00e7\u00e3o na matriz em dire\u00e7\u00e3o ao p\u00f3lo positivo. Por exemplo, o azul de bromofenol migra juntamente com um fragmento de DNA de aproximadamente com 0,3kb e o xileno cianol com um fragmento de 4 kb em g\u00e9is de agarose de 0,5 a 1,4% em TAE. H\u00e1 ainda corantes que migram mais rapidamente, como o Amarelo G, que acompanha fragmentos menores que 100pb. Estes corantes podem ser adicionados simultaneamente no tamp\u00e3o de amostra, ou utilizados individualmente, dependendo da disponibilidade e objetivo do experimento.
\nPara permitir uma estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA de uma dada amostra \u00e9 necess\u00e1rio aplicar em um dos po\u00e7os o marcador de massa molecular (ladder<\/i>). O\u00a0ladder<\/i>\u00a0\u00e9 uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentra\u00e7\u00f5es conhecidos, gerados a partir da digest\u00e3o de plasm\u00eddeos (tipo de DNA circular presente em bact\u00e9rias) com enzimas de restri\u00e7\u00e3o. Ele permite inferir, por compara\u00e7\u00e3o, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada.
\nExistem no mercado diversos tipos de\u00a0ladders<\/i>, que variam no tamanho dos fragmentos de DNA presentes na solu\u00e7\u00e3o. Dentre os mais utilizados, destacam-se os marcadores\u00a0Ladder<\/i>\u00a01kb, que cont\u00e9m 13 fragmentos que v\u00e3o de 0,3 a aproximadamente 10 kb; e o\u00a0Ladder\u00a0<\/i>100bp que cont\u00e9m 14 fragmentos\u00a0 que variam de 0,1 a 5 kb, com duas bandas de alta intensidade em 1,5 e 2 kb.<\/p>\n

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Corrida de eletroforese:<\/strong><\/p>\n

Ap\u00f3s a aplica\u00e7\u00e3o das amostras, encaixa-se a tampa da cuba contendo os cabos que permitir\u00e3o a conex\u00e3o entre a cuba e a fonte de corrente cont\u00ednua.
\nPara se determinar a voltagem que ser\u00e1 utilizada deve-se computar a dist\u00e2ncia entre os eletrodos e n\u00e3o o comprimento do gel. Geralmente usa-se uma voltagem de 1 a 5 V\/cm. Voltagens excessivas ou muito baixas interferem na mobilidade do DNA e causam distor\u00e7\u00f5es na migra\u00e7\u00e3o. Para cubas rotineiramente utilizadas pela maioria dos laborat\u00f3rios de pesquisa, a voltagem varia entre 50 e 110 V.
\nDurante a corrida o DNA sair\u00e1 do po\u00e7o, penetrar\u00e1 no gel, migrando em dire\u00e7\u00e3o ao p\u00f3lo positivo. Com isso os fragmentos ser\u00e3o separados de acordo com o tamanho. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os fragmentos maiores, pois eles apresentam maior facilidade de atravessar os poros da matriz de agarose em dire\u00e7\u00e3o ao p\u00f3lo positivo. Enquanto que fragmentos de mesmo tamanho migram praticamente juntos.
\nNo caso da utiliza\u00e7\u00e3o do azul de bromofenol, quando este atingir \u00be do gel a corrente pode ser desligada. Entretanto, h\u00e1 varia\u00e7\u00f5es de acordo com o tamanho do fragmento de DNA de interesse. Se o fragmento for muito grande, aguarda-se a separa\u00e7\u00e3o dos fragmentos maiores na parte superior do gel e n\u00e3o h\u00e1 tanta preocupa\u00e7\u00e3o com a parte inferior. Neste caso, o corante pode at\u00e9 sair do gel.<\/p>\n

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An\u00e1lise e registro dos resultados:<\/strong><\/p>\n

O m\u00e9todo mais usual para se visualizar o DNA em g\u00e9is de agarose \u00e9 por colora\u00e7\u00e3o com brometo de et\u00eddeo (EtBr) de f\u00f3rmula C21H2OBrN3. Esse corante se intercala entre as bases dos \u00e1cidos nucl\u00e9icos e, na presen\u00e7a de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). Com este m\u00e9todo pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluoresc\u00eancia emitida \u00e9 proporcional \u00e0 concentra\u00e7\u00e3o de DNA presente na amostra. O brometo de et\u00eddeo pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tamp\u00e3o da amostra a ser aplicada, ou ap\u00f3s a corrida quando o gel \u00e9 submergido em solu\u00e7\u00e3o de EtBr.
\nNo entanto, n\u00e3o \u00e9 recomendada a incorpora\u00e7\u00e3o do brometo de et\u00eddeo no gel porque esse corante interfere no padr\u00e3o de migra\u00e7\u00e3o das diversas conforma\u00e7\u00f5es que a mol\u00e9cula de DNA pode assumir. Segundo, e n\u00e3o menos importante, devido \u00e0 contamina\u00e7\u00e3o da vidraria, da cuba e demais utens\u00edlios usados na prepara\u00e7\u00e3o do gel.
\nCorantes fluorescentes at\u00f3xicos s\u00e3o boas op\u00e7\u00f5es alternativas (Yung-Sharp e Kumar, 1989) para visualizar o DNA. Alguns exemplos dispon\u00edveis no mercado s\u00e3o: o Azul de Metileno (Flores, et al, 1992), que n\u00e3o apresenta potencial mutag\u00eanico e n\u00e3o requer luz U.V, embora apresente a desvantagem de ser pouco sens\u00edvel; o Sybr Safe\u00ae, um corante fluorescente que cora o DNA no gel de agarose e no gel de poliacrilamida exibindo a mesma sensibilidade que o brometo de et\u00eddeo e visualizado no transiluminador de luz azul; e o\u00a0GelRed<\/i>\u00a0e o\u00a0GelGreen<\/i>\u00a0que pelo fato de serem termoest\u00e1veis podem ser adicionados antes da homogeniza\u00e7\u00e3o do gel.
\nOs grupos de mol\u00e9culas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do po\u00e7o e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Ap\u00f3s a visualiza\u00e7\u00e3o os resultados geralmente s\u00e3o fotodocumentados. No caso de g\u00e9is corados com brometo de et\u00eddio, as fotos devem ser adquiridas sob luz ultravioleta. Para tal, utiliza-se filme\u00a0Polaroid (<\/i>branco e preto) ou um software capaz de transformar em imagem a intensidade relativa de fluoresc\u00eancia emitida pelas bandas de DNA captadas por uma c\u00e2mera fotogr\u00e1fica digital. Em alguns laborat\u00f3rios, a fim de minimizar os potenciais efeitos danosos da luz ultravioleta, o gel corado com brometo de et\u00eddio \u00e9 colocado dentro de uma c\u00e2mara e a luz U.V s\u00f3 \u00e9 ligada com a c\u00e2mara fechada. Uma c\u00e2mera acoplada registra a foto do gel.<\/p>\n

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Fatores que influenciam a migra\u00e7\u00e3o do DNA:<\/strong><\/p>\n

A mobilidade eletrofor\u00e9tica do DNA atrav\u00e9s do gel de agarose \u00e9 influenciada por v\u00e1rios fatores que ser\u00e3o discutidos a seguir.<\/p>\n